Measuring Tumor Antigen-Specific Immunity Through ELISpot and FluoroSpot

執筆者:

David Draper

日付:

2020年3月

 

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腫瘍抗原特異的応答効果を高めることが免疫療法で目指す結果です。 抗腫瘍免疫の急激な増加、もしくは長命の免疫記憶の形成によって、宿主の適応免疫応答を促進する薬剤では、より高い臨床的効果が期待できます1さまざまなアッセイで抗原特異性を測定できるものの、その多くはモデルに特化した試薬の使用、遺伝子操作を施した動物、または細胞サブセットの精製工程を必要とするため、制限があります。コーヴァンス前臨床オンコロジーは、ELISpot/FluoroSpot 分析によりシンプルで手頃なソリューションを提供します。

ELISpot と FluroSpot はサンドイッチ ELISA ベースの技術を使用して、可用性対象を生成および放出する細胞の頻度を測定します。市販キットを使って、サイトカイン、ケモカイン、免疫グロブリン、成長因子などの対象を測定することができます。コーヴァンスでは、単色酵素結合免疫スポット分析対象を 1 つ(ELISpot)と多色蛍光ベースの分析対象を 3 つ(FluoroSpot)まで同時にご提供します。図 1 は、腫瘍特異的 IFNγ と IL-4 産生細胞の分析のための FluoroSpot 手順を図解で説明したものです。

図 1: ELISpot/FluoroSpot 手順
図 1: ELISpot/FluoroSpot 手順

この技術スポットライトでは、Hepa1-6-luc マウス肝細胞癌モデルを使用した前臨床 immuno-oncology 研究における、ELISpot/FluoroSpot の適用を実証します(図 2)。この目的のために、FluoroSpot を使して担癌マウスの末梢血中内の腫瘍特異的免疫を測定したところ、抗 PD-1 治療の In vivo チェックポイント阻害では、INFNy を産生する循環腫瘍特異的細胞の数が増加することがわかりました。さらに、抗 PD-1 は、IFNγ/IL-4 サイトカインプロファイルを免疫抑制反応からより炎症性の高い抗腫瘍シグネチャにシフトします。

図 2:Hepa1-6-luc 担癌マウスにおける抗腫瘍免疫の FluoroSpot 分析。 Hepa1-6-luc 腫瘍が定着した C57BL/6 マウスに、抗PD-1 または、アイソタイプコントロール抗体を投与。 末梢血 200µL からの白血球は照射された Hepa1-6-luc 細胞と培養。 A) CTL ImmunoSpot® S6 ユニバーサルアナライザを使った IFNγ および IL-4 分泌細胞の頻度の定量。 B) 各マウスにおける IFNγ 産生細胞の頻度と腫瘍量の比較分析。 C) IFNγ/IL-4 産生細胞の比率を測定して評価した各マウスの Th1/Th2 バランス。​​​​​​​
図 2:Hepa1-6-luc 担癌マウスにおける抗腫瘍免疫の FluoroSpot 分析。Hepa1-6-luc 腫瘍が定着した C57BL/6 マウスに、抗PD-1 または、アイソタイプコントロール抗体を投与。末梢血 200µL からの白血球は照射された Hepa1-6-luc 細胞と培養。A) CTL ImmunoSpot® S6 ユニバーサルアナライザを使った IFNγ および IL-4 分泌細胞の頻度の定量。B) 各マウスにおける IFNγ 産生細胞の頻度と腫瘍量の比較分析。C) IFNγ/IL-4 産生細胞の比率を測定して評価した各マウスの Th1/Th2 バランス。​​​​​​​

ワクチンの作用機序と同様に、腫瘍の増大は抗体とサイトカイン産生腫瘍特異的細胞からなる適応免疫応答を誘発します1。応答の質は、IFNγ および IL-4 の検査によって特徴付けられます。IFNγ は細胞毒性を介した T 細胞が増大することで腫瘍の成長を阻害することが十分立証されています。その一方で、IL-4 はさまざまな免疫抑制効果を通して腫瘍の成長を促します。この二分法は、Th1/Th2 バランス2とよく呼ばれます。図 2 で示す通り、抗 PD-1 は、ex vivo で刺激を与えた後に腫瘍応答性細胞が IFNy を産生する頻度を増加させました。一方、IL-4 産生細胞の頻度は大きく増えることはありませんでした。これは、チェックポイント阻害が抗腫瘍防御免疫の増強を引き起こしたことを示唆しています。この裏付けとして、IFNγ 産生細胞の頻度が最も高かったマウスでは、腫瘍量が最小限にとどまりました。さらに、抗 PD-1 は IFNγ/IL-4 産生細胞の比率を増加させました。これは腫瘍が最小量であったマウスにも最も顕著に表れました。

総合すると、このデータセットは ELISpot/FluoroSpot がどのように腫瘍特異的免疫応答に関してさらなる薬物効果を明らかにできるかを示しています。また、このアッセイは少量の血液で実施できるため、ELISpot/FluoroSpot は、縦軸の有効アームに適用することも可能です。そのため、この研究に対して 2 番目のサンプリングアームを追加することなく、薬物作用に関する機構的洞察を得る機会が提供されます。ELISpot/FluoroSpot を前臨床オンコロジーおよび immuno-ocology 研究に応用する方法につきましては、コーヴァンス前臨床オンコロジー担当のサイエンティストまでお問合せください。

参照:

1. Immunity; 52.1 (2020): 36-54

2. Cancer Immunology, Immunotherapy; 57.8 (2008): 1125-1136.