ルシフェラーゼ

ルシフェラーゼで細胞株から光り輝く結果を獲得

ホタル(P. pyralis、フォティヌス・ピラリス)のルシフェラーゼは、D-ルシフェリンがあると生物発光を起こす酵素です。ルシフェラーゼ 2 (luc2) 遺伝子の DNA を、レンチウイルス形質導入システムを用いて、ピューロマイシン耐性遺伝子とともに、細胞のゲノム中に組み込みます。

細胞を培養している間にピューロマイシンを培地に加え、ルシフェラーゼ遺伝子が組み込まれた細胞のみを選択できるようにします。ルシフェラーゼが活性化した細胞をマウスまたはラットに注入し、D-ルシフェリンを静脈内投与すると発光します。それを Molecular Imaging 社の IVIS® スペクトラム In vivo イメージングシステムで検出することができます(図 1)。この方法により、注入された細胞の局在と蓄積を時間の経過とともにモニタリングすることができます。多くの場合、癌の進行/退行をモニタリングする目的で、癌細胞でルシフェラーゼが活性化されます。

図 1: in vivo イメージングシステムの IVIS® スペクトラムで検出された、ルシフェラーゼが成分となった腫瘍細胞の発光

ルシフェラーゼ 2 遺伝子とともに、DNA を組み込んだ蛍光タンパク質も、細胞のゲノムに同時に加えることができます。緑色蛍光タンパク質(GFP)、赤色蛍光タンパク質(RFP)、またはその他任意の蛍光タンパク質などの蛍光タンパク質遺伝子を組み込んだ後、分子イメージングは、Attune™ NxT アコースティックフォーカシング フローサイトメトリー(図 2)または蛍光顕微鏡(図 3)を使用して細胞を検出することができます。蛍光標識された細胞をマウスまたはラットに注入した後は、異なる組織内のこれらの細胞の割合を経時的に測定することができます。また、蛍光標識された細胞から、細胞周期の分析、アポトーシス分析、内部および/または外部マーカーの発現の分析も行うことができます。

図 2: Attune™ NxT アコースティックフォーカシング フローサイトメトリーを使用して検出された細胞内の GFP
図 3: GFP を含むルシフェラーゼ発現細胞の明視野蛍光顕微(左)と GFP 蛍光顕微(右)。

細胞の種類によって異なるプロモーターで遺伝子を発現させるため、EF1 アルファ、CMV、UbC、MSCV など、様々なプロモーターを使用することができます。また、遺伝子導入を効率よく行うために、ウイルスの偽型を VSV-G または MLV に変えることもできます。

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