薬物間相互作用およびトランスポーター

体内の多くの関門組織にある膜薬物トランスポーターは、薬物と相互作用して In vivo での吸収、分布、排出に影響を与える可能性があり、臨床的に関連のある薬物間相互作用 (DDI) の原因となります。被験物質が基質であるか、それともトランスポーターの阻害剤かを判別することで、併用薬物における臨床的に関連のある曝露と毒性の変化を説明できます。

薬物の腸透過性は、吸収される割合を高める重要な要素であり、Caco-2 単層トランスポーターアッセイを使用して評価できます。

トランスポーターの相互作用に関する規制上の考慮事項

これらの研究は、ファーストインヒューマン臨床試験に進む前にトランスポーター相互作用を評価する目的で、FDA と EMA の薬物間相互作用(DDI)ガイドラインの両方で推奨されています。トランスポーターの研究は、薬物が吸収や分布に影響を与えるため、併用薬物の有効な血漿濃度の達成における潜在的な問題を明らかにします。

臨床での使用においては、いくつかのトランスポーターが薬物と相互作用します。試験に推奨されるものには以下が含まれます。

  • ATP 結合カセット (ABC) 流出トランスポーター P-糖タンパク質 (P-gp)、乳癌耐性タンパク質 (BCRP)、および胆汁酸塩輸出ポンプ (BSEP)。
  • 溶質担体 (SLC) 取り込みトランスポーター有機アニオントランスポーター (OAT) 1 および OAT3、有機カチオントランスポーター (OCT) 2、有機アニオン輸送ポリペプチド (OATP) 1B1、OATP1B3、多剤および毒素排出 (MATE) 1 および MATE2 K。

トランスポーター相互作用の方法:

取り込みトランスポーターアッセイ
  • 試験システム:単一取り込み (SLC) トランスポーターまたはベクターコントロールを発現するトランスフェクト細胞株を 5% CO2 の加湿インキュベーターにより 37°C で単層培養します。
  • アッセイバッファー:HEPES を含む HBSS、pH 7.4
  • MATE トランスポーターについてのみ、細胞を NH4Cl で前処理し、MATE 取り込み活性に必要な pH 勾配を細胞膜全体に導入します。
  • 被験物質濃度:基質アッセイは 2、阻害アッセイは 2
  • 各トランスポーターに個別の放射標識プローブ基質
  • 各トランスポーターについて陽性対照阻害剤を使用

培地中のトランスポーター発現細胞を、アッセイバッファーにより 5% CO2 の加湿インキュベーターにおいて 37°C で 30 分間前培養します。MATE 発現細胞を NH4CI で処理して細胞膜全体に pH 勾配を作り、取り込み活動を促進します。三重のウェルにプローブ基質または被験物質を添加し、必要に応じて阻害剤を加えます。プレートは、トランスポーターに応じて 2 ~ 10 分の 1 時点で培養されます。バッファーを吸引します。次に細胞を洗浄してから溶解・収集し、LC-MS を使用して被験物質があるか分析します。

基質評価:各トランスポーター単独か、選択的阻害剤の存在下での被験物質の取り込みを、2~5 分間培養した後のベクターコントロールによる取り込みと比較します。各トランスポーター単独か、選択的阻害剤の存在下でのプローブ基質の取り込みと、ベクターコントロールによる取り込みを対照として実施します。

阻害剤の評価:各トランスポーターによるプローブ基質の取り込みを、単独、または選択的阻害剤あるいは被験物質の存在下で実施します。ベクターコントロールによるプローブ基質の取り込みも対照として実施します。阻害が観察されると、IC50 を特定できます。

流出トランスポーターアッセイ
  • 試験システム:Caco-2 ヒト腸内皮細胞を Transwell プレート上で 5% CO2 の加湿インキュベーターにおいて 37°Cで 21~24 日間培養
  • アッセイバッファー:頂端チャンバーと基底チャンバーの両方の HEPES を含む HBSS、pH 7.4
  • アッセイの前に経内皮電気抵抗 (TEER) を測定し、密着な結合の形成を確認 
  • 被験物質濃度:基質アッセイは 2、阻害アッセイは 2
  • 放射性標識透過性マーカーのマンニトールとカフェインを使用して、密着な結合の形成を確認
  • 各トランスポーターに個別の放射性標識プローブ基質を使用
  • 各トランスポーターについて、陽性対照の選択的阻害剤と陰性対照の阻害剤を使用

被験物質とプローブ基質の明確な透過性は、トランスウェルプレートの頂端から基底外側(A-B)と基底外側から頂端(B-A)の両方向で特定されます。37℃、5% CO2 の加湿インキュベーターでアッセイバッファーを 30 分間前培養した後、プローブまたは被験物質を一方のチャンバー(ドナー)に添加し、もう一方のチャンバー(レシーバー)にブランクのバッファーを添加します。  次に、該当する場合には、阻害剤を両チャンバーに添加します。プレートを 37°C、5% CO2 で 2 時間培養します。ドナーとレシーバーのチャンバーのサンプルを回収し、LC-MS を使用して被験物質の有無について分析します。次に、被験物質の透過率と流出率を判定します。

基質評価:被験物質の輸送は、単独または選択的阻害剤の存在下において両方向で判定されます。  プローブ基質の輸送は、各トランスポーターの単独または選択的阻害剤の存在下において対照として実施されます。

阻害剤の評価:プローブ基質の輸送は、単独または選択的阻害剤もしくは被験物質の存在下での 2 時間の培養後に両方向で判定されます。  流出輸送の阻害が観察されると、IC50 を判定することができます。

小胞膜取り込みアッセイ
  • 試験システム:流出(ABC)トランスポーター BSEP を発現する膜小胞(50µg /ウェル)。
  • 被験物質濃度:基質アッセイは 2、阻害アッセイは 2。
  • アデノシン一リン酸(AMP)を対照として使用し、アデノシン三リン酸(ATP)依存活性を測定します。
  • BSEP 固有の放射性標識プローブ基質
  • 各トランスポーターについて陽性対照阻害剤を使用

BSEP を発現する膜小胞、および被験物質またはプローブ基質を 96 ウェルプレートで培養します。取り込みは、アデノシン三リン酸(ATP)の添加により開始され、その後 37°C で 30 分間培養します。陰性対照としてアデノシン一リン酸(AMP)が並行して使用されます。取り込みは真空吸引で終了し、たっぷりの氷冷の輸送バッファーでフィルターを 2 回すすぎます。次に、LC‑MS 定量法および ATP 依存活性の算出のために、小胞がフィルタープレートから抽出されます。

基質評価:ATP 存在下で被験物質の単独および選択的阻害剤を用いた取り込みを、AMP 存在下での取り込みと比較します。  BSEP の単独および選択的阻害剤の存在下でのプローブ基質の取り込みを、対照として実施します。

阻害剤の評価:プローブ基質の取り込みを、単独および選択的阻害剤あるいは被験物質の存在下で実施します。ATP 存在下での取り込みが AMP 存在下での取り込みと比較されます。  被験物質の ATP に依存した取り込みに阻害が観察されると、IC50 を判定することができます。

 

成果物

これらのアッセイは、基質や阻害剤の膜薬物トランスポーターとの相互作用を識別してプロファイリングします。データは、取り込みや流出またはその両方の程度、被験物質の透過率、トランスポーター阻害、および IC50 値を適宜説明します。

こうしたデータは、併用療法との相互作用の可能性に基づいて DDI リスクを評価するためにも使用でき、新薬候補のランク付けに役立てることができます。相互作用が観察された場合には、ファーマコメトリクス​​​​​​​により、治験の必要性を評価する際の補足的なガイダンスができる場合があります。