酵素誘導

医薬品の代謝の質を研究する際に、その医薬品が酵素発現を誘導または増強する場合、併用薬物の有効な血漿濃度の達成における潜在的な問題を明らかにするため、酵素誘導試験も合わせて実施すると良いでしょう。酵素誘導が起こると、活性代謝物の全身曝露の増大によって、代謝クリアランスまたは毒性が増加することがあります。 

CYP 酵素(主に CYP1A2、CYP2B6、CYP3A4)の誘導は、ヒト肝細胞の単層培養における被験物質への暴露後に In vitro で測定されます。

初期実験では、CYP1A2、CYP2B6、および CYP3A4 酵素を誘導する可能性について調べます。CYP3A4 酵素の誘導が見られた場合、治験依頼者は CYP2C 酵素(CYP2C8、CYP2C9、CYP2C19)の誘導の可能性も評価すべきでしょう。そして、その作用を調査中の CYP 酵素の陽性対照誘導剤によるものと比較します。また、Ex vivo 動物肝(通常はマウス、ラット、イヌ、またはサル)を用いて細胞下分画を行い、安全性評価試験中に In vivo 投与した後の薬物代謝酵素に対する被験物質の媒介作用を評価することができます。 

酵素誘導試験の規制に関する考慮事項

これらの試験は FDA と EMA の薬物間相互作用(DDI)に関するガイドラインにおいて、CYP1A2、CYP2B6、CYP2C8、CYP2C9、CYP2C19、および CYP3A4 のチトクローム P450 誘導を、ファーストインヒューマン試験に進む前に評価するものとして推奨されています。

誘導データは臨床 DDI 試験の範囲と要件を決定するために用いられます。

 

方法

  • 試験システム:凍結保存された個別のヒトドナーによる肝細胞
  • CYP 酵素の評価:CYP1A2、CYP2B6、CYP2C8、CYP2C9、CYP2C19、CYP3A4/5
  • 被験物質濃度:溶解度で制限されない限り、予測された臨床曝露(0.1 - 10X Cmax)を一括するように選択されます。濃度は、細胞毒性は 5 種類、mRNA 誘導は 7 種類、酵素活性誘導は 3 種類を選択
  • 培養時間:72 時間(24 時間ごとに培地を更新)

細胞毒性

前臨床アッセイでは、1 人のドナーの肝細胞を、37°C、CO2 5% の加湿インキュベーターで 72 時間、被験物質(5 種類の濃度)または陽性対照タモキシフェン(50 µM)の存在下で、三通りのウェルで培養します。24 時間ごとに培地 ± 被験物質または対照を交換します。72 時間後、MTS アッセイを用いて肝細胞の生存率を評価します。その結果を使用して、誘導アッセイで使用する毒性のない被験物質の濃度を判定します。

安定性

細胞毒性アッセイと組み合わせて、培地サンプルを採取し、被験物質の経時的な濃度を評価します。

CYP mRNA 誘導

3 人のドナーの肝細胞を、37°C、CO2 5% の加湿インキュベーターで 72 時間、被験物質(7 種類の濃度)または対照誘導剤(下記参照)の存在下 / 非存在下で、三通りのウェルで培養します。24 時間ごとに培地 ± 被験物質または対照を交換します。72 時間後、mRNA を抽出し、遺伝子発現を定量 PCR でリアルタイムに判定します。各 CYP mRNA のレベルは内因性制御遺伝子(例:GAPDH)のレベルに正規化されます。それから、2-ΔΔCT 法を用いて CYP 遺伝子発現の倍加誘導を算出します。CYP mRNA レベルにおける被験物質依存の増加率が溶媒対照群の 2 倍以上、あるいは反応が陽性対照の反応の 20% 以上であれば、結果は陽性として解釈できます。

CYP 酵素誘導

3 人のドナーの肝細胞を、37°C、CO2 5% の加湿インキュベーターで 72 時間、被験物質(3 種類の濃度)または対照誘導剤(上記参照)の存在下 / 非存在下で、三通りのウェルで培養します。培地 ± 被験物質または対照は 24 時間おきに交換します。72 時間後、適切な CYP 基質(下記参照)を含む新しい培地で肝細胞を 2 時間培養します。その後、反応を停止してサンプルを採取し、液体クロマトグラフィー質量分析(LC-MS)法を用いて代謝物(下記参照)を分析します。CYP 酵素活性における被験物質依存の増加率が溶媒対照群の 2 倍以上、あるいは反応が陽性対照の反応の 20% 以上であれば、結果は陽性として解釈できます。

 

 

 

酵素活性アッセイ

CYP 酵素

誘導剤

非誘導剤

基質

検体

CYP1A2

オメプラゾール

フルマゼニル

フェナセチン

アセトアミノフェン

CYP2B6

フェノバルビタール

フルマゼニル

ブプロピオン

ヒドロキシブプロピオン

CYP3A4/5

リファンピシン

フルマゼニル

ミダゾラム

1'-ヒドロキシミダゾラム

 

成果物

これらのアッセイは、mRNA と酵素活性レベルを既知の CYP 酵素誘導剤と比較します。該当する場合は、EC50 と Emax が提供されます。

陽性結果が観察されると、ファーマコメトリクスにより、治験の必要性を評価する際の補足的なガイダンスができる場合があります。