酵素誘導

• 試験システム：凍結保存された個別のヒトドナーによる肝細胞
• CYP 酵素の評価：CYP1A2、CYP2B6、CYP2C8、CYP2C9、CYP2C19、CYP3A4/5
• 被験物質濃度：溶解度で制限されない限り、予測された臨床曝露（0.1 - 10X C_max）を一括するように選択されます。濃度は、細胞毒性は 5 種類、mRNA 誘導は 7 種類、酵素活性誘導は 3 種類を選択
• 培養時間：72 時間（24 時間ごとに培地を更新）

細胞毒性

前臨床アッセイでは、1 人のドナーの肝細胞を、37°C、CO2 5% の加湿インキュベーターで 72 時間、被験物質（5 種類の濃度）または陽性対照タモキシフェン（50 µM）の存在下で、三通りのウェルで培養します。24 時間ごとに培地 ± 被験物質または対照を交換します。72 時間後、MTS アッセイを用いて肝細胞の生存率を評価します。その結果を使用して、誘導アッセイで使用する毒性のない被験物質の濃度を判定します。

安定性

細胞毒性アッセイと組み合わせて、培地サンプルを採取し、被験物質の経時的な濃度を評価します。

CYP mRNA 誘導

3 人のドナーの肝細胞を、37°C、CO2 5% の加湿インキュベーターで 72 時間、被験物質（7 種類の濃度）または対照誘導剤（下記参照）の存在下 / 非存在下で、三通りのウェルで培養します。24 時間ごとに培地 ± 被験物質または対照を交換します。72 時間後、mRNA を抽出し、遺伝子発現を定量 PCR でリアルタイムに判定します。各 CYP mRNA のレベルは内因性制御遺伝子（例：GAPDH）のレベルに正規化されます。それから、2-ΔΔCT 法を用いて CYP 遺伝子発現の倍加誘導を算出します。CYP mRNA レベルにおける被験物質依存の増加率が溶媒対照群の 2 倍以上、あるいは反応が陽性対照の反応の 20% 以上であれば、結果は陽性として解釈できます。

CYP 酵素誘導

3 人のドナーの肝細胞を、37°C、CO2 5% の加湿インキュベーターで 72 時間、被験物質（3 種類の濃度）または対照誘導剤（上記参照）の存在下 / 非存在下で、三通りのウェルで培養します。培地 ± 被験物質または対照は 24 時間おきに交換します。72 時間後、適切な CYP 基質（下記参照）を含む新しい培地で肝細胞を 2 時間培養します。その後、反応を停止してサンプルを採取し、液体クロマトグラフィー質量分析（LC-MS）法を用いて代謝物（下記参照）を分析します。CYP 酵素活性における被験物質依存の増加率が溶媒対照群の 2 倍以上、あるいは反応が陽性対照の反応の 20% 以上であれば、結果は陽性として解釈できます。