- 試験システム:各種または特定の血漿タンパク溶液からのプール血漿(ヒト血清アルブミン、α1-酸性糖タンパク質、γ グロブリンなど)
- 濃度は、溶解度で制限されない限り、既知の臨床曝露 (0.1 - 10X Cmax) を一括するように選択されます。
平衡透析
平衡透析は、ハイスループット透析装置(HTDialysis LLC、コネチカット州ゲールズフェリー)を使用して実施されます。ダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水 (DPBS) を各ウェルのレシーバーチャンバーに添加しながら、強化された基質(血漿または分離血漿タンパク質)をドナーチャンバーに添加します。次に、プレートをガス透過性の膜で密封し、指定の時間、 5% CO2 で 37°C で培養します(以下を参照)。培養後、各チャンバーからのサンプルは液体クロマトグラフィー質量分析法 (LC-MS) を使用して分析されます。
- 基質の安定性:被験物質を血漿および DPBS 内で、最大 5 つの時点まで単一濃度で培養します。
- 平衡化までの時間:被験物質を血漿に単一濃度で添加し、DPBS に対して最大 5 つの時点で透析します。
- タンパク結合濃度依存性:被験物質を血漿に 3 つの濃度で添加し、平衡に必要な時間だけ DPBS に対して透析します。
- ワルファリンなどの陽性対照は、同時平衡透析で 5 時間以上テストされます。
限外ろ過
強化された血漿は、分画分子量が 30,000 Da の限外ろ過装置のサンプルリザーバー部分に添加されます。サンプルは 37°C、2,000 × g で(または他の適切な条件で)15 分間遠心分離されます。遠心分離後、限外ろ過液を被験物質に対して LC-MS で分析し、初期濃度と比較した含有量を調べます。すべてのタンパク結合測定は 3 回実施されます。
- 非特異的結合:対照血漿限外ろ過液 (PUF) に 2 種類の濃度で被験物質を添加し、限外ろ過の手順に従って遠心分離します。透析液を分析して、被験物質の回収および血漿がない場合の潜在的な非特異的結合を判定します。
- タンパク結合濃度依存性:試験物質を 5 種類の濃度で血漿に添加し、限外ろ過の手順に従って遠心分離します。限外ろ過液が被験物質に対して分析されます。
超遠心分離法
強化された血漿を超遠心管に添加し、37ºC、223,000 × g で(または他の適切な条件で)4 時間遠心分離機にかけて、血漿タンパク質から血漿超遠心分離を行います。遠心分離後、超遠心分離液を LC-MS で分析して初期濃度と比較します。
- 非特異的結合:対照ヒト血漿と対照血漿限外ろ過液 (PUF) に 2 種類の濃度で被験物質を添加し、超遠心管で 4 時間培養します。基質を分析して、血漿の非存在下での被験物質の回収および潜在的な非特異的結合を特定します。
- タンパク結合濃度依存性:被験物質を 5 種類の濃度で血漿に添加し、超遠心分離の手順に従って遠心分離します。超遠心分離液を被験物質に対して分析します。