タンパク結合

体循環に薬剤が入って現れてから、遊離および非結合分画のみが薬理学的(または毒性学的)効果を与えることができます。血漿タンパク結合の程度は、平衡透析法、限外ろ過法または超遠心分離法により、In vitro または ex vivo で特定できます。被験物質の赤血球対血漿の分配は、動物およびヒトの血液において In vitro または ex vivo で判定することができます。ミクロソームタンパク結合は、平衡透析法で評価できます。薬理、薬物動態、毒性の面からのデータ評価を支援するため、薬剤が血漿タンパク質にどのように結合し、血液血漿間分配がどのように機能するのかを説明するデータが必要とされています。

血漿タンパク結合、血液血漿間分配、ミクロソームタンパク結合の研究に関する規制上の考慮事項

被験物質の血漿またはミクロソームタンパク非結合分画の調査は、臨床薬理学における用量、曝露、有効性、安全域の In vivo PK プロファイルを特性化するうえで極めて重要です。血漿タンパク結合の種間評価は IND の要件のひとつであり、ICH M3(R2) ガイダンスで詳しく説明されています。



血漿タンパク結合の方法
  • 試験システム:各種または特定の血漿タンパク溶液からのプール血漿(ヒト血清アルブミン、α1-酸性糖タンパク質、γ グロブリンなど)
  • 濃度は、溶解度で制限されない限り、既知の臨床曝露 (0.1 - 10X Cmax) を一括するように選択されます。

平衡透析

平衡透析は、ハイスループット透析装置(HTDialysis LLC、コネチカット州ゲールズフェリー)を使用して実施されます。  ダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水 (DPBS) を各ウェルのレシーバーチャンバーに添加しながら、強化された基質(血漿または分離血漿タンパク質)をドナーチャンバーに添加します。次に、プレートをガス透過性の膜で密封し、指定の時間、 5% CO2 で 37°C で培養します(以下を参照)。培養後、各チャンバーからのサンプルは液体クロマトグラフィー質量分析法 (LC-MS) を使用して分析されます。

  • 基質の安定性:被験物質を血漿および DPBS 内で、最大 5 つの時点まで単一濃度で培養します。
  • 平衡化までの時間:被験物質を血漿に単一濃度で添加し、DPBS に対して最大 5 つの時点で透析します。
  • タンパク結合濃度依存性:被験物質を血漿に 3 つの濃度で添加し、平衡に必要な時間だけ DPBS に対して透析します。 
  • ワルファリンなどの陽性対照は、同時平衡透析で 5 時間以上テストされます。

限外ろ過

強化された血漿は、分画分子量が 30,000 Da の限外ろ過装置のサンプルリザーバー部分に添加されます。サンプルは 37°C、2,000 × g で(または他の適切な条件で)15 分間遠心分離されます。遠心分離後、限外ろ過液を被験物質に対して LC-MS で分析し、初期濃度と比較した含有量を調べます。すべてのタンパク結合測定は 3 回実施されます。 

  • 非特異的結合:対照血漿限外ろ過液 (PUF) に 2 種類の濃度で被験物質を添加し、限外ろ過の手順に従って遠心分離します。透析液を分析して、被験物質の回収および血漿がない場合の潜在的な非特異的結合を判定します。
  • タンパク結合濃度依存性:試験物質を 5 種類の濃度で血漿に添加し、限外ろ過の手順に従って遠心分離します。限外ろ過液が被験物質に対して分析されます。

超遠心分離法

強化された血漿を超遠心管に添加し、37ºC、223,000 × g で(または他の適切な条件で)4 時間遠心分離機にかけて、血漿タンパク質から血漿超遠心分離を行います。遠心分離後、超遠心分離液を LC-MS で分析して初期濃度と比較します。 

  • 非特異的結合:対照ヒト血漿と対照血漿限外ろ過液 (PUF) に 2 種類の濃度で被験物質を添加し、超遠心管で 4 時間培養します。基質を分析して、血漿の非存在下での被験物質の回収および潜在的な非特異的結合を特定します。
  • タンパク結合濃度依存性:被験物質を 5 種類の濃度で血漿に添加し、超遠心分離の手順に従って遠心分離します。超遠心分離液を被験物質に対して分析します。
血液血漿間分配の方法

BPP 研究は、ヒトを含むさまざまな種の血液中の被験物質の In vitro 血液血漿間分配を特定するために使用されます。

  • 試験システム:各動物種から得られた血液が少なくとも 3 体のドナーからプールされます。少なくとも 3 人のボランティアから得られたヒトの血液はプールされません。
  • プールされた動物の血液サンプルと個々のヒト血液サンプルに対して、ヘマトクリット値が判定されます。
  • 血液は 2~8°C で保存され、受領後 1 週間以内にできるだけ早く使用されます。 

被験物質を血液に添加し、最初のアリコートを採取します。強化された血液を指示に従って 37℃ で培養します。培養後、分析のためにアリコートを除去します。  残りの血液を遠心分離して血漿を採取します。アリコートを分析のために収集し、最初のアリコートと比較します。

  • 基質の安定性:被験物質を血中において単一濃度で最大 4 時点で培養します。
  • 平衡化までの時間:被験物質を血液に単一濃度で最大 4 時点まで添加します。
  • タンパク結合濃度依存性:試験物質を最大 5 種類の濃度で血液に添加し、平衡時点まで培養します。

放射性標識化された被験物質の場合は、液体シンチレーション計測 (LSC) の前に、血液のアリコートを可溶化します。放射性標識化していない被験物質の場合は、抽出して液体クロマトグラフィー質量分析法 (LC-MS) により分析する前に、血液のアリコートを溶解します。

ミクロソームタンパク結合の方法

被験物質が In vitro でヒト肝臓ミクロソームタンパク質に結合する可能性を評価することで、こうしたシステムを用いたアッセイにおける未結合分画の補正が可能になります。

平衡透析は、ハイスループット透析装置(HTDialysis LLC、コネチカット州ゲールズフェリー)を使用して三重に実施されます。  アッセイバッファーを各ウェルのレシーバーチャンバーに添加しながら、強化されたミクロソームをドナーチャンバーに添加します。次に、プレートをガス透過性の膜で密封し、5 時間、5% CO2 において 37°C で培養します。培養後、各チャンバーからのサンプルは液体クロマトグラフィー質量分析法 (LC-MS) を使用して分析されます。

  • タンパク結合:ヒト肝臓ミクロソームがリン酸緩衝液で 3 種類の濃度(0.05、0.1、0.5 mg / mL)に希釈されます。次に、被験物質を 3 種類の濃度でミクロソームに添加し、サンプルが計 9 つとなるようにします。強化された基質サンプルは、三重で HTD ドナーチャンバーに移され、リン酸塩に対して 5 時間透析されます。
  • ミクロソームでの安定性:前述の強化された基質サンプルを、5% CO2 において 37°C で 0 時間と 5 時間それぞれ培養します。

 

成果物

血漿タンパク結合アッセイは、被験物質の結合の程度を識別し、結合と非結合のパーセント、透析平衡までの時間、ヒトおよび他の選択した前臨床種の濃度依存プロファイルを提供します。血液血漿間分配からは分配係数が得られます。次に、これらのデータを使用して血漿中の遊離分画を算出し、In vivo での曝露を補正して有効性と安全域をプロファイリングすることができます。  

ミクロソームタンパク結合アッセイは、ヒト肝臓ミクロソームタンパク質に被験物質が結合する程度を特定します。これにより、薬剤の遊離型画分を説明する IC50 またはその他のパラメータを補正することができます。