フローサイトメトリー

癌研究と治療における最も新しい画期的発明は、Immuno-Oncology の分野で生まれています。これには、宿主の免疫系を強化し、より効果的に腫瘍細胞を標的として破壊する新しい免疫療法が用いられています。FDA の承認を受けた治療法のうち、免疫調節活性を利用したものには、抗体、サイトカインベースの免疫療法、低分子医薬品、細胞ベースの治療法があります。これらを含む治療法が生存期間の延長に成功したことで、癌治療の効果を高める新しい単剤の開発と併用療法に重点が置かれています。

免疫療法開発の生産性を高めるには、腫瘍内微小環境、末梢血、その他宿主組織における免疫系について、ハイスループットと確かな定量分析が求められます。

このためコーヴァンスの契約フローサイトメトリーサービスでは、最先端の高度な解析フローサイトメトリーに関するリソースを提供し、お客様の医薬品開発のあらゆるニーズをサポートしています。当社のサービスを利用して試料生成試験を行うか、前臨床または CLIA 未認定の臨床試料を翌日配達便で当社までお送りください。コーヴァンスがお客様に代わってフローサイトメトリーを行います。

フロー(流れ)に乗る:フローサイトメトリーにおける主な課題とそのソリューション - CYTO 2017 にて


包括的な免疫プロファイリングの基礎

50 年以上にわたって積み重ねてきたさまざまな分野の経験をもとにフルサービスを提供するコーヴァンスの分析チームは、あらゆる In vivo 試験に Ex vivo フローサイトメトリーの機能を追加することができます。標準化されたコーヴァンスの抗体パネル(下記参照)は、いずれも複数の In vivo 癌モデルにおいて検証済みです。リンパ系および骨髄細胞系の幅広い免疫サブセットを包括的に分析する際の基礎となり、In vivo 試験薬治療により生じる免疫応答の変化をとらえます。下記にパネルの一覧をご紹介します。

基礎 T 細胞パネル

マウス 4T1 乳癌モデルにおける腫瘍浸潤 CD4+ および CD8+ T 細胞分析

腫瘍浸潤 T 細胞の定量的測定は、新たな免疫療法の免疫調節効果を評価する上で非常に重要です。基礎 T 細胞パネルは T 細胞サブセットを測定するもので、複数の組織型で検証されています。上述の試験では、4T1 乳癌に移植された乳房脂肪体の T 細胞サブセットを Ex vivo で分析しました。 CD45+ 造血細胞のゲーティングにより CD3+ T 細胞を最初に特定し、  T 細胞集団については、CD4 と CD8 の系統マーカー発現をもとに、さらに詳細な分析を行いました。

マウス 4T1 乳癌モデルにおける腫瘍浸潤 CD4+ および CD8+ T 細胞分析
基礎 T & B 細胞パネル

マウス脾臓における T 細胞と B 細胞のサブセット分析

基礎 T 細胞および B 細胞パネルは、不均一なサンプルにおいて、CD4+ T 細胞と CD8+ T 細胞、そして B 細胞分画を定量化するために使用されます。このパネルは 6 つの蛍光チャネルしか使用しないため、他の抗体でさらに細胞液滴の特性化をする際に、使用されていないチャネルを利用することができます。 上述の試験では、生細胞ゲートで CD3+ T 細胞と CD19+ B 細胞を分析し、 さらに T 細胞を CD4+ 群と CD8+ 群に細分化しました。

制御性 T 細胞パネル

マウス CT.26 大腸腫瘍モデルにおける制御性 T 細胞分析

いくつかの疾患モデルにおいて抗腫瘍反応を抑制する制御性 T 細胞は、新しい免疫治療にとって魅力的な標的です。制御性 T 細胞パネルは基礎 T 細胞パネルを拡張したもので、制御性 T 細胞を標的とする新しい治療法の効果を評価するために使用できます。上述の試験では、CT.26 腺癌関連宿主からの脾臓における制御性 T 細胞の Ex vivo 分析を行いました。 CD45+CD3+ 細胞のゲーティングにより CD4+ T 細胞を最初に特定し、 CD25 および FoxP3 の共発現に基づいて制御性 T 細胞をさらに分化しました。
 マウス CT.26 大腸腫瘍モデルにおける制御性 T 細胞分析
T 細胞活性化 / 疲弊パネル
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マウス A20 B 細胞リンパ腫における T 細胞活性化の分析

新しい免疫療法の開発中に直面する問題の一つに、腫瘍微小環境内の T 細胞で発生する抗腫瘍活性の喪失があります。T 細胞の疲弊と呼ばれるこうした状態は、様々な免疫チェックポイントや活性化マーカーに関連する発現をもとに特定することができます。T 細胞活性化 / 疲弊パネルは基礎 T 細胞パネルを拡張したもので、様々な組織で一部の主なバイオマーカーに対する発現を測定するために使用します。上述の試験では、A20 細胞株由来の腫瘍内の T 細胞サブセットで免疫チェックポイントタンパク質 CTLA-4 および PD-1、そして代替増殖マーカー Ki-67 の発現を測定しました。

包括的 T 細胞パネル
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T 細胞パネルを用いた免疫チェックポイント / 活性化マーカー研究を取り入れた CD4+、CD8+、および制御性 T 細胞の分析

包括的 T 細胞パネルは、基礎、制御性、および T 細胞活性化 / 疲弊の各パネルの有用性を、一つの包括的な組織内 T 細胞プロファイル分析にまとめたものです。上図はそれぞれ、(A) 4T1 乳癌モデルを用いたマウス腫瘍における CD4+/CD8+ T 細胞サブセット分析、(B) CT.26 結腸直腸腺癌関連宿主からの脾臓における制御性 T 細胞分析、(C) A20(B 細胞リンパ腫)細胞株由来腫瘍からの T 細胞サブセットにおける CTLA-4、PD-1、および Ki-67 の発現レベルを示します。
ナチュラルキラー細胞パネル

CT.26 結腸直腸腺癌モデルにおけるナチュラルキラー(NK : Natural Killer)細胞および樹状細胞(DC : Dendritic Cell)サブセット分析

NK 細胞サブセットは抗腫瘍活性を持ち、多くの腫瘍の増殖を制御することで知られています。DC は腫瘍促進性と抗腫瘍性の両方の機能を持ち、ワクチンによる免疫療法の標的となります。NKDC(別名 IKDC)は NK 細胞と DC の両方の機能的特徴を持つことが分かっています。ナチュラルキラー細胞パネルは、これらのサブセットを特定することができます。上述の試験は、腫瘍由来 Ly6G-Ly6C- 免疫細胞内の NK 細胞、DC、NKDC のサブセットのパーセンテージを定量化するために実施されました。

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骨髄由来抑制細胞パネル

マウス CT.26 大腸腫瘍モデルにおける骨髄由来抑制細胞(MDSC: Myeloid-Derived Suppressor Cell)分析

免疫機能の抑制をはじめとするいくつかの腫瘍促進反応に影響を及ぼす MDSC サブセットは、免疫療法の魅力的な標的です。このサブセットは異種遺伝子型細胞集団で、 その表現型は腫瘍微小環境内の信号によって形成されます。上記のデータは、MDSC パネルを用いた CT.26 由来腫瘍における顆粒球性(G-)MDSC と単球性(M-)MDSC のサブセットの基本的な同定を示しています。 まず CD3+CD19+ リンパ球の除去後に CD45+ ゲートで CD11b+ 骨髄細胞を特定し、 Ly-6G と Ly-6C 表面受容体の発現に基づいて G-MDSC と M-MDSC をさらに分化しました。

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拡張骨髄パネル

マウス CT.26 大腸腫瘍モデルにおける骨髄由来抑制細胞(MDSC)、ナチュラルキラー(NK)細胞、樹状細胞(DC)のサブセットの分析

拡張骨髄パネルは基礎 MDSC パネルを拡張したもので、MDSC 集団に加え、NK と DC のサブセットの分析が可能になります。ここに示すデータは、CT.26 由来腫瘍においてこれらのサブセットを分析したものです。単球性(M-)MDSC と顆粒球性(G-)MDSC は、それぞれ高レベルの Ly-6C タンパク質および Ly-6G タンパク質を示し(明るい部分)、CD11b マーカーを共発現しています。NK と DC を MDSC 除外ゲートで分析し、汎 NK マーカー(CD49b および CD335)ならびに DC 特異的 CD11c タンパク質発現に基づいて比較して、さらに分化しました。赤色と灰色のピークはそれぞれ CD11b の染色細胞と未染色細胞を示します。

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包括的骨髄パネル
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MI Bioresearch の包括的骨髄パネルを用いた腫瘍における骨髄細胞分析

包括的骨髄パネルは基礎骨髄由来抑制細胞パネルをベースとし、骨髄細胞集団のより詳細な分析を行います。また、腫瘍と免疫細胞の両サブセットに対して免疫抑制性受容体 PD-L1 の分析を可能にします。上記のデータは、包括的骨髄パネルを用いて以下を実行できることを証明しています:A) 腫瘍細胞および免疫細胞の PD-L1 発現の測定(4T1 乳癌モデル)、B) マクロファージ細胞サブセットおよび樹状細胞サブセットの定量化(CT.26 大腸腫瘍モデル)、C) 抑制作用(CT.26 大腸腫瘍モデル)との直接的な相関関係を示す受容体である CD115 の発現のための MDSC サブセットの特性化。また、このパネルは好中球集団と単球集団の分析にも有益です(データ表示なし)。赤色と灰色のピークは、それぞれ標的抗原の染色細胞と未染色細胞を示しています。

M1 および M2 腫瘍関連マクロファージパネル
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CT.26 結腸直腸腺癌モデルにおける古典的活性化(M1)および選択的活性化(M2)腫瘍関連マクロファージの分析

M1 マクロファージと M2 マクロファージは、腫瘍微小環境に存在する 2 つの代表的なマクロファージ集団です。この 2 つは癌の進行に関して反対の機能を持つため、新しい免疫療法の標的とされます。上述の試験は、M1 および M2 腫瘍関連マクロファージパネルを用いてこの 2 つの集団の比率をおおまかに示す方法を実証しています。このため、MDSC サブセットを除外し、CD11b+/F480+ マクロファージを特定できるようにしています。  そして、この部分を M2 マクロファージ(CD206+)および M2 マクロファージ(CD206-MHCII+)について分析しました。